爱提力牛奶免疫蛋白

篇一：牛奶中蛋白质含量的测定

牛奶中蛋白质含量的测定

摘要：通过国标牛奶中蛋白质的测定找出它的不足之处，用新的方法进行蛋白质的测定。

关键词：蛋白质 测定凯氏定氮法微 波消解—凯式定氮法 Bradford法 甲醛值滴定法

牛奶是一种营养丰富而全面的理想食品,是人体所需蛋白质的重要来源,蛋白质是牛奶中的主要营养指标。因此，牛奶中蛋白质的测定是一件非常重要的事，也是大家非常关注的事。

用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍 【GB/T 5009.5—1985】 食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2 试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

2.1 硫酸铜。

2.2 硫酸钾。

2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2.6 40%氢氧化钠溶液。

2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。

3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示。 （图略）

4 操作方法

4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。

4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量，%； V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m——样品的质量(体积)，g(ml)； F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

附加说明： 本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。 本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

微波消解—凯式定氮法 凯式定氮法是测定蛋白质含量的法定方法，测定结果稳定、准确，但此方法存在消解时间长，使用消解溶剂用量大，易造成环境污染等缺点。 而微波消解具有操作简便、消解速度快、所需消解溶剂少、消解能力强等优点。本文采用微波消解法代替凯式定氮法中的消化方式，减少了试剂用量，缩短了消解时间。试验表明，该测定方法与传统的凯式定氮法无显著性差异，适用于大批量蛋白质含量的测定。

仪器 MDS－2003F 微波消解仪；凯式定氮蒸馏装置；KDN－08C 型恒温消解仪；FA2004 型电子天平；可调温电炉。所用玻璃仪器均以 20 ％硝酸浸泡过夜，用水冲洗，去离子水冲洗干净。

主要试剂 硫酸，优级纯；过氧化氢（30 ％），分析纯；硫酸铵（标准品）；氢氧化钠溶液（400 g/L）；硼酸溶液（20 g/L）；盐酸标准溶液（0.050 8 mol/L）；甲基红－溴甲酚绿混合指示剂 （1 份 0.1 ％甲基红乙醇溶液与 5 份 0.1 ％溴甲

酚绿乙醇溶液临用时混合）。

样品消化 准确称取 0.5 g 样品放入消解罐中， 加入 3 mL 硫酸和 1.5 mL 过氧化氢，盖好密封碗，装好罐，在设定的消解程序下进行消解处理，如样品消解不完全有黑色碳粒， 可再加入 0.5 mL 硫酸和 0. 5 mL 过氧化氢继续消解。 消

解完毕，待消解罐充分冷却后，将消解液转移至 25 mL 容量瓶中，用少量去离子水洗涤盖子、安全阀和消解罐的内壁一并转入容量瓶，用去离子水定容待测。 同时做空白试验。

样品测定 取 5 mL 消化好的样品溶液进行凯式定氮蒸馏，加入一定量的 40 ％的氢氧化钠溶液使蒸馏器内的内溶物变棕色为止， 馏出液用 0.050 8 mol/L 的标准盐酸滴定，溶液颜色由蓝色变为紫红色为滴定终点，计算蛋白质含量。 总蛋白质/%=M(V1-V2)*14*6.38*100/1000/W 式中：M 为标准盐酸的摩尔浓度，mol/L；V1为滴定样品时消耗盐酸溶液的体积，mL；V2为滴定空白消化液时消耗盐酸的体积，mL；W 为样品的重量，g；14为氮的相对原子量。

微波消解是近年来产生的一种崭新的样品处理技术，它结合了高压消解和微波快速加热两方面的性能。 该法的优点是：①微波加热是“内加热”，具有加热速度快、加热均匀、无温度梯度、无滞后效应等特点。②消解样品的能力强，特别是一些难溶样品，传统的消解方式需要数小时甚至数天，而微波消解只需要几分钟至十几分钟。 ③溶剂用量少， 用密封容器微波溶样时，溶剂没有蒸发损失，一般只需溶剂 5 mL~10 mL。 ④减少了劳动强度，改善了操作环境，避免了有害气体排放对环境造成的污染。 ⑤由于样品采用密闭消解，有效地减少了易挥发元素的损失。

优点 将蛋白质测定中消解方法改为微波消解法，由于样品与试剂的反应是在密闭的容器内进行的，所以对环境的污染大大减小，采用硫酸和过氧化氢混合液为消解试剂，试剂用量少，消化速度快且消化彻底。 仪器在设定的程序下，可自动完成消解操作，操作方便，减轻了分析人员的工作强度，提高了工作效率。 三聚氰胺事件引发的食品安全问题已经影响了整个食品行业。 它属于难代谢物质，如果进入人和动物体内能不同程度的导致肾衰竭或者死亡，还能导致结石诱发膀胱和泌尿系统疾病，因此对牛奶中的蛋白质测定也提出了更高的要求。经典的食品蛋白质（包括牛奶）含量的测定，方法繁琐，耗时长，最关键的是样品中所有的含氮物质中所含的氮元素，都被转换成硫酸铵，充当了蛋白质含量。因此导致了个别不法商家向牛奶中添加含氮物质如尿素、三聚氰胺等，危害消费者的身体健康。牛奶中蛋白质的测定，一般使用凯氏定氮法，须经强酸消化，然后蒸馏，再经滴定，方法繁琐，耗时长（约需2-3ｈ）；而且凯氏定氮法测定的是样品中所有的含氮物质，无法区分蛋白质氮还是非蛋白质氮，而采用Bradford法测定蛋质含量，步骤简单，耗时短（约需0.5ｈ），并且考马斯亮蓝试剂与尿素和三聚氰胺不发生显色反应，可用于牛奶中蛋白质含量的快速测定。样品、干扰品制备 用水将牛奶稀释得50倍牛奶稀释样品；另取部分稀释液加入尿素使之浓度为0.2ｍｇ／ｍＬ，再取部分稀释液加入三聚氰胺使之浓度为0.5ｍｇ/ｍＬ。

材料、试剂与仪器 牛奶；染色剂：考马斯亮蓝，称取100ｍｇ考马斯亮蓝Ｇ－250染料溶于50ｍL95％的乙醇后，再加120ｍL85％磷酸，用水稀释定容到1L。混合指示剂：10ｍL1ｇ/L的甲基红乙醇溶液与5ｍL1ｇ/L的亚甲基蓝乙醇溶液混合。盐酸标准滴定液 ：0.0530ｍｏｌ/L。标准蛋白质溶液：1.0ｍｇ/ｍL的牛血清白蛋白；尿素、三聚氰胺、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、

95％乙醇：皆为国产分析纯；可见分光光度计：722Ｎ，上海精密科学仪器有限公司；凯氏定氮仪：江苏江都市红旗玻璃厂；分析天平：ＡＲ1140。 Bradford法操作步骤

(1)标准曲线的制作：取７支试管，依次加入0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10ｍＬ的1.0ｍｇ/ｍＬ标准蛋白质溶液，用水补充到0.1ｍL，最后加入5.0ｍＬ考马斯亮蓝染色剂，每加完１管立即混匀。反应2-5min后比色，以0管调零，于595nm波长测定各管吸光度，并制作标准曲线。

(2)待测管：取30支试管分为3组，第一组加入0.1ｍL的50倍牛奶稀释样品，第二组加入0.1ｍＬ的尿素干扰样品，第三组加入0.1ｍL的三聚氰胺干扰样品，测定吸光度。根据标准曲线求得相应蛋白质含量。

(3)凯氏定氮法操作步骤 取10支定氮瓶，分别加入5.0ｍL牛奶，加硫酸铜0.2ｇ，硫酸钾6ｇ，硫酸20ｍL，2粒玻璃珠，瓶口置一漏斗，置于电热板上小心加热，待内容物完全碳化，加大火力，消化至透明，继续加热半小时放冷，将消化液定容至50ｍL。同时做空白。向收集瓶内加入10.0ｍL硼酸溶液（20ｇ/L）及2滴混合指示液。取10ｍL消化液由小玻杯加入反应室，用10ｍL水洗涤，再加10.0ｍL氢氧化钠溶液（400ｇ/L），盖紧塞子，加水密封，加紧旋夹，蒸馏10min。蒸馏液用0.0530mol/L盐酸滴定液滴定，计算出样品蛋白质含量。氮换算蛋白质系数以6.38计.

比较 试验中按照牛奶内最大含氮量加入干扰物三聚氰胺或尿素，结果显示，干扰物三聚氰胺或尿素，对吸光度无影响。因此对于Bradford法而言，牛奶中添加三聚氰胺或尿素，无法提高表观蛋白质含量，这是Bradford法与凯氏定氮法最大的区别。本法存在的问题是，所测定的蛋白质含量与凯氏定氮法所测定的含量有一定偏差，经多次测定结果比较，将Bradford法测定结果乘以1.1等于凯氏定氮法结果，目前，尚不了解引起该偏差的原因。

甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量

我国现行国家标准方法是以食品中的含氮量为依据测定蛋白质含量,测得的结果不完全是蛋白质,还包括一些非蛋白质类的含氮物质,如尿素氮、游离氨氮、无机氨盐等;国标GB/T 5009·5—2003食品中蛋白质的测定规定的凯氏定氮法、可见分光光度法完成一个样品的测定,需要3 h以上,不能满足快速测定的需要,更难以解决牛奶中蛋白质的掺伪检验难题。本文参考文献资料[2]研究并建立了牛奶中蛋白质的快速检验方法-甲醛值滴定法,测定牛奶蛋白质中游离氨基酸含量,计算求得牛奶中蛋白质含量。本方法准确、简便、快速并有效地解决了非蛋白质类的含氮物质对牛奶与奶制品中蛋白质测定结果的干扰问题。

方法原理 牛奶中蛋白质含量与游离氨基酸含量呈良好的正相关。氨基酸为两性电解质,在接近中性的水溶液中,全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后,与中性的游离氨基酸中非解离型氨基反应,生成单羟甲基和二羟甲基诱导体,使氨

基酸失去氨基特性,游离的羧基(-COOH)可以用标准碱溶液滴定,根据碱溶液的消耗量得出游离氨基酸含量,乘以经验常数计算出蛋白质的含量。

仪器 碱式滴定装置。样品 3个品牌的成品纯牛奶和1个企业的鲜原料牛奶。试剂 饱和草酸钾溶液:330 g/L;酚酞指示液:5g/L,用乙醇溶液配制;氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0·1 mol/L];氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=0·05 mol/L];中性甲醛水溶液。

测定方法 准确吸取奶样10·0 ml于三角瓶中,加入0·5 ml饱和草酸钾溶液和0·5 ml酚酞指示液,约2 min后用0·1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色。然后加入2 ml中性甲醛溶液,再用0·05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至粉红色,记录滴定消耗的0·05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。 结果表述 牛奶中蛋白质的含量X(g/100 ml)

=CV1*0·014*6·38×100*100/5.006/V 式中:C—氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,单位为mol/L;V1—加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗氢氧化钠标准定溶液的体积,单位为ml;0·014—1ml 1 mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的克数;6·38—氮换算为蛋白质的系数;100/5·006—经验常数,由本方法实测值与国标法(凯氏定氮)测定值相比较计算得出;V—样品的体积,ml成品。计算结果保留三位有效数字。

现行国标方法不能排除非蛋白氮对测定结果的影响,而甲醛值法有效地解决了非蛋白氮干扰问题,适用于牛奶与奶粉中重要的营养指标蛋白质的快速定量检验。本方法与现行的国标方法(凯氏定氮法)相比,牛奶中蛋白质的测定时间缩短为3-5 min,提高工作效率约50倍,适用于牛奶中蛋白质的快速定量检验。 此外，还有一些方法来测定牛奶中蛋白质的含量，比如用直接电位法测定牛奶中蛋白质含量等等。

参考文献：

1. 蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

2. 沈文，陈均志，代春吉微波消解—凯式定氮法测定牛奶中蛋白质含量食品研究与开发2009（5）30-5

3. 田志梅甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量中国食品卫生杂志2008.20-3

4. 张志涛 刘金生等Bradford法测定牛奶中蛋白质含量安全与检测2011.5

篇二：牛奶中蛋白质测定过程

测定牛奶中的蛋白质含量

牛奶是日常生活中一种营养价值高的食物，其营养价值主要集中在蛋白质上。蛋白质能促进人体心血管的健康，而且能改善睡眠状况，控制高血压，增强身体的免疫机能。 实验目的：测定牛奶中蛋白质含量

实验试剂：鲜牛奶一袋、浓硫酸、NaOH（40%）、硫酸标定液（0.01mol/L）、H3BO3（2%）、混合指示液（甲基红、溴甲酚绿）

K2SO4、CuSO4·5H2O作做催化剂

实验主要仪器：消化管、锥形瓶、天平、凯氏微量定氮仪一套等

实验方法：凯氏定氮法，样品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后在凯氏定氮器中加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用硫酸滴定，根据酸的消耗量，再乘以一定的数值（6.25）即为蛋白含量。

原理：蛋白质是含氮的有机化合物。由于蛋白质含氮量比较恒定，约为16%，所以蛋白质含量=N/16%=N*6.25。测出含氮量即能得出蛋白质含量。

实验步骤（过程记录）：

1、样品消化：将牛奶10mL置于消化管内，加入催化剂5g，并沿烧瓶壁缓缓加入20mL浓硫酸，使全部样品浸没于硫酸。接着将消化管放在消化炉支架上，把支架连同装有试样的消化管一起移至电热炉上。设定温度在420℃保持消化管中液体连续沸腾。待溶液消煮至无微小碳粒、呈蓝绿色时，继续消煮一会。同一方法做试剂空白实验。

消化结束，等其冷却至室温。冷却过程中，防止废气泻出。

2、样品蒸馏：使自来水经过给水口进入冷凝管。然后打开定氮仪总电源开关，启动仪器待蒸汽导出管放出蒸汽，按消除按钮停止加热。在蒸馏导出管托架上，放上已经加入适量的15ml接受液（硼酸和混合指示剂）的锥形瓶。抬起锥形瓶支架使蒸馏导出管的末端浸入接受液内。

再在消化完全冷却后的消化管内，逐个加入10mL左右蒸馏水稀释样品。而后开始蒸馏，到时或到量时自动停止。用洗瓶将蒸馏水冲洗接收，取下锥形瓶。最后加碱：按下碱按钮，使NaOH溶液加至蒸馏液碱性颜色变黑为止。

3.加酸滴定：用标定后的硫酸溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰紫色为滴定终点。同时吸取试剂空白消化液按2、3操作。

实验分析（计算）：

牛奶蛋白质含量（g/100ml）=（V1-V2）*C*0.014/(V/100)*100*6.25

项 目 数据

10 V:牛奶的体积（ml）

3.26 V1：空白试样消耗标准硫酸溶液的体积（ml）

6.94 V2：牛奶试样消耗标准硫酸溶液的体积（ml）

C: 酸标准溶液浓度：0.01 mol/L 0.0140——氮的毫克当量数

(6.94-3.26)*0.01*0.014/(10/100)*100*6.25=3.22g/100ml

实验结论：牛奶试样中蛋白质含量为3.22g/100ml

实验反思：

蒸馏反应室里的溶液总体积要控制，否则反应室溶液体积太大，液面升高，容易喷进冷凝管内。

实验样品需控制为均匀大小，大块的固体样品应用粉碎设备打得细小均匀，液体样品应震摇或搅拌均匀。

消化过程中需让消解溶液沸腾均匀后再提高消解温度，直至消化液呈透明蓝绿色再消化半小时左右。否则可能导致在炭化过程中，升温速度过快使样品溢出消化管或溅起粘附在管壁，

使其无法消化完全而造成氮损失，影响结果准确性。

感悟体会：该牛奶包装袋上的蛋白质标识为3.4g/100ml,可见实验结果于其相近。尽管有误差，可这次实验还是很成功。当然这复杂的实验离不开化学老师的帮助与书籍、资料的参考。 通过本实验的操作实践，我学会了用凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质含量的方法和操作原理，掌握了基本的操作过程，从中也感悟到科学的严密性和严谨性，提高了实践能力和动手能力。

陈屹东

篇三：牛奶中蛋白质的测定分析

牛奶中蛋白质的测定分析 蛋白质是生物的重要组成部分，在人类发现蛋白质后一直没有停下过研究得脚步。蛋白质是生命的物质基础没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的惟一来源, 具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转和遗传等密切相关, 其分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、诊断疾病、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。随着分析手段的不断进步, 对食品中蛋白质含量的测定方法也正向准确和快速的方向发展。在实 验室提取蛋白质的过程中，目标蛋白质的来源是广泛的，而不同的样品中目标蛋白质的含量是不同的，为了得到更多的目标蛋白，就需要了解样品中蛋白质的含量。在实际的生活中也需要运用蛋白质含量的测定，例如牛奶、奶粉中蛋白质含量。记得前几年轰动一时三聚氰胺事件，国家的标准蛋白质检测方法被不法分子所利用，通过蛋白质检测方法的缺陷来谋取暴利。目前常用的蛋白质检测方法有五种：凯式定氮法、福林-酚法、考马斯亮蓝法、紫外法、双缩脲法。不同的方法有不同的优缺点。

一、双缩脲法

双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与

Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。

二 、 考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质与染料结合的原理定量测定微量蛋白浓度的方法。这种蛋白质测定法快速、灵敏、优点突出，因而得到广泛的应用。考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质定量方法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（ma）位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即

可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

三 、福林-酚法

在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物。该复合物随后将磷钼酸-磷钨酸还原发生显色反应，产生蓝色（钨兰+钼兰）。蓝色的强度在蛋白质浓度为25~250μg/mL之间时与蛋白质的含量成正比。 根据多组标准蛋白质溶液与福林-酚试剂反应后所测得的吸光度绘制标准曲线。以此便可求出未知蛋白质溶液中的蛋白质含量。 Cu和Folin试剂联合测定蛋白质具有以下优点：（1）与纳氏（Nessler）试剂一样灵敏，而不需要消化；（2）灵敏度为测定280 nm处紫外吸收的10～20倍，特异性更强且对浊度干扰较不敏感；（3）灵敏度为茚三酮反应的数倍[23]且操作简便更适于小规模分析。茚三酮反应中，游离氨基酸比蛋白质显更多色，而与Folin试剂正好相反；

（4）灵敏度为双缩脲反应的100倍。Folin反应有两个主要的缺点：

（1）显色量随蛋白质的不同有差异。从这一方面看，Folin反应的稳定情况不如双缩脲反应，但高于测定280 nm处的吸收；（2）色与浓度并不呈严格地比例关系。

考虑到Cu-Folin反应的优点和缺点，这一反应的可能应用包括：

（1）酶分级分离等过程中蛋白质的测量；（2）混合组织蛋白质的测

量，尤其是不要求绝对值时；（3）绝对微量或高度稀释蛋白质的测量（如脊髓液）及与有色或其他含氮物质混合的蛋白质；（4）相似蛋白质样品的大量分析，如抗原-抗体沉淀物。

四 、 紫外法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的

pH相一致。

五 、凯氏定氮法

目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法。凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，此法的结果称为粗蛋白质含量。由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，所以凯氏定氮不能分辨蛋白质与其他含氮化合物。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法。至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器，所以选用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮仪是依据经典凯氏定氮方法设计的自动测定系统，根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量。该仪器安装、操作简单;适用于粮油检测、饲料分析、植物养分测试、土肥检测、环保、医药、化工等行业的分析、教学及研究中主要用来检测粮食、食品、乳制品、饮料、饲料、土壤、水、药物、沉淀物和化学品等中的氨氮、蛋白质氮等含量，是操作人员的理想工具，同时利用定氮仪也可以测二氧化硫等物质，是实验室比较重要的理化分析仪器。 样品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与

篇四：牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较

牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较

刘春波——12生工2——20120802224

摘 要：采用福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法对牛奶中蛋白酶的活力进行测定，通过对测定结果的统计学分析和回收率试验 探究3种方法的差异。 结果表明：3种方法均能从不同角度反映出牛奶的蛋白酶活力。 福林法具有精确度和准确度高、重现性好等优点， 虽然操作复杂，但能够更为直接客观的反映出牛奶的蛋白酶活力，适合于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比色法具有 较好的精确度和准确度，结果重现性好，反应时间短，但测定过程中由温度引起的十二烷基磺酸钠（SDS）溶解性问题对测定结果影响 较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的精确比较；福林法虽然操作简便，但精确度和准确度较差，结果重现性不好，适合于牛奶中蛋白 酶活力的粗略性和比较性测定。

关键词：牛奶；蛋白酶；福林法；邻苯二甲醛衍生比色法；甲醛法

前言：蛋白凝块现象是牛奶储存过程中较为常见的质 量问题[1，2]。 研究表明，蛋白凝块是由牛奶中的蛋白酶 水解乳蛋白生成肽、氨基酸所引起的[3-5]。 为了控制蛋 白酶引起的质量问题，需要对牛奶中蛋白酶活力进行 测定。 酱曲、糙米、豆粕等的蛋白酶活力测定已有成熟 的方法[6-8]，而牛奶中蛋白酶活力的测定始终没有统一 的标准和方法。 据文献报道，采用的测定方法有甲醛 法[9]、邻苯二甲醛衍生法[10]和福林试剂法[11]，但对于不 同测定方法的比较却鲜有报道。 本研究选用福林法、邻苯二甲醛衍生法和甲醛法 这三种方法对牛奶中蛋白酶活力进行测定，评价选择 出更适合牛奶中蛋白酶活力的测定方法，为生产控和产品质量检测提供理论依据。

1.1 材料与试剂

市售UHT利乐砖纯牛奶； 福林试剂，L-苯丙氨 酸，L-酪氨酸，酪素（化学纯），无水碳酸钠，三氯乙酸， 十二烷基磺酸钠（SDS），四硼酸钠（分析纯），邻苯二甲 醛（化学纯），-巯基乙醇（分析纯）。

1.2 仪器与设备 TU-1901紫外可见分光光度计，LD4-2A低速离 心机，HWS-26电热恒温水浴锅，78HW-1恒温磁力搅 拌器，XK96-A快速混匀器，PHS-3C pH计。

1.3 方法

1.3.1 福林法测定牛奶中蛋白酶活力 参考GB/T 23527-2009的方法略作修改[12]。 此方 法原理是蛋白酶在一定的温度和pH下能够水解酪素 底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸，在碱性条件 下与福林试剂反应，生成钼蓝与钨蓝，通过紫外分光光度计测定，从而计算出蛋白酶的活力[13]。 分别取不同质量浓度的酪氨酸标准溶液（0，10， 20，30，40，50 mg/L）各1 mL，加入浓度为0.4 mol/L的 碳酸钠溶液5 mL， 福林试剂溶液1 mL， 显色反应在 （40±0.2） ℃中持续20 min。将反应液取出后，在680 nm 下测定其吸光度。 根据酪氨酸不同浓度对应的吸光度 值绘制标准曲线。 取1 mL待测牛奶样品，加入10 g/L的酪素溶液 1 mL，在（40±0.2） ℃下反应10 min，取出静置后过滤。 再取滤液1 mL，

与5 mL的碳酸钠溶液、1 mL的福林试 剂混合后，在（40±0.2） ℃下显色20 min，于680 nm下 测定其吸光度。 空白组测定方法相同，只是在加入酪 素之前先加入三氯乙酸使蛋白酶失活。 牛奶中蛋白酶 活力为 X=AK×4/10， 式中：X为牛奶样品的蛋白酶活力（u/mL）；A为牛 奶样品的吸光度；K为吸光常数（即根据回归方程计算 出当吸光度为1时的酪氨酸的量）；4为反应试剂的总 体积；10为反应时间。

1.3.2 邻苯二甲醛衍生比色法测定牛奶中蛋白酶活力 参考Church[14]和张艳[10]的方法略作修改。 此方法 的原理是邻苯二甲醛衍生试剂在碱性介质中与游离 氨基酸反应生成异吲哚衍生物，在340 nm下有特征吸 收， 通过测定吸光度计算出牛奶中游离氨基氮的浓 度，以此反映出蛋白酶的活力。 将40 mg的邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇中， 分别加 入25 mL浓度为100 mmol/L的四硼酸钠、2.5 mL10%的 SDS、100 L的 -巯基乙醇，加水定容至50 mL，即为邻 苯二甲醛衍生试剂（OPA）。 分别取不同浓度的苯丙氨酸标准溶液（0，0.5，1， 1.5，2，2.5，3，3.5，4 mmol/L） 各150 μL， 加入3 mL的 OPA试剂，室温下反应2 min，340 nm下测定其吸光度 值。 根据苯丙氨酸不同浓度对应的吸光度绘制标准曲 线。 取10 mL待测的牛奶样品在4 000 r/min下离心 分离20 min，以脱去脂肪。 取脱脂后的牛奶样品 2.5 mL，分别加入5 mL质量分数为12%的三氯乙酸、 0.5 mL蒸馏水，在2 000 r/min下离心15 min。 取清液 150 μL，加入3 mL的OPA试剂，室温下反应2 min， 340 nm下测定其吸光度值。 根据苯丙氨酸标准曲线 计算出牛奶中游离氨态氮的浓度。

1.3.3 甲醛法测定牛奶中蛋白酶活力 采用康小红[9]的方法并进行修改。此方法是通过测 定牛奶中氨基酸态氮的质量浓度来反映蛋白酶的活 力。其原理是利用了氨基酸的两性作用，甲醛能够固定 氨基的碱性，使氨基酸的羧基显示出酸性，通过氢氧化 钠标准溶液滴定来定量，以酸度计测定滴定终点。 具体方法： 取60 mL待测的牛奶样品于200 mL锥 形瓶中，开动磁力搅拌器，用浓度为0.05 mol/L的氢氧 化钠标准溶液进行滴定， 至pH值为

8.2时记下消耗的 氢氧化钠标准溶液的毫升数，此数据可反映出牛奶中的总酸质量浓度。 加入10 mL甲醛溶液后，再用浓度为 0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH值为

9.2， 记下此时消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，以 此计算出牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度。 以水为 空白对照。 牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度按以下 公式计算： X=

[(V1-V2)×c×0.014]/V3×100， 式中：X为牛奶样品中氨基酸态氮的质量浓度；V1 为牛奶中加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液的体 积；V2为空白组加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液 的体积；V3为牛奶样品的取用量；c为氢氧化钠标准溶 液的浓度。

2.4 3种测定方法的比较

从测定原理来看，福林法、邻苯二甲醛衍生比色 法和甲醛法这3种测定蛋白酶活力的方法都是以测定 产物氨基酸的量来表示蛋白酶活力。 但是，福林法是 对蛋白酶分解酪素产生的含有酚基的氨基酸进行测 定，以酪氨酸的量来表示牛奶中氨基酸的量，邻苯二 甲醛比色法是通过对与邻苯二甲醛衍生试剂反应的 游离氨基酸进行测定，以苯丙氨酸的量来表

示牛奶中 氨基酸的量，甲醛法则是通过消耗碱液的量来测定氨 基酸态氮的质量浓度，以氨基酸态氮的质量浓度来表 示牛奶中氨基酸的量。 3种测定方法和表达方式有所 不同，但福林法从原理上能够更为实际地反映出牛奶 中蛋白酶的活力。 从检测过程来看，福林法反应条件苛刻，试剂大 多需要现配现用，操作复杂；邻苯二甲醛衍生比色法 反应时间最短，操作较甲醛法稍显复杂，测定过程中 温度对SDS溶解性影响较大，SDS的溶解性对吸光度 又有直接影响，因而在测定中对温度的控制增加了操 作的复杂性；甲醛法是3种方法中操作最为简便的，反 应时间适中。 从测定结果来看，福林法精确度和准确度高，3次 重复实验中结果重现性好；邻苯二甲醛衍生比色法精 确度和准确度也高，3次重复试验中结果重现性较福 林法较差，这可能是由于测定中环境的温度变化引起 吸光度的差异；甲醛法精确度和准确度均较低，3次重 复试验中结果重现性较差。 将3种方法测定的结果进 行比较分析，其所测得牛奶中蛋白酶活力的表达方式 不同，福林法得到的酶活力单位为u/mL，邻苯二甲醛 法得到的酶活力是以每升牛奶中游离氨基氮的毫摩 数来表示，而甲醛法测得的酶活力是以100 mL牛奶中 氨基酸态氮的克数来表示， 很难直接进行数值比较。 因此，对牛奶样品进行稀释，分别用3种方法测定稀释 后牛奶的蛋白酶活力，结果如表10所示。 运用统计学 的相关分析（t检验：成对双样品均值分析）对三组数据 进行处理，福林法和邻苯二甲醛衍生比色法测定结果 的相关系数为0.986，福林法和甲醛法测定结果的相关系数为0.956，邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法测定结 果的相关系数为0.983， 表明3种方法的变化趋势是一 样的， 都可以从不同角度反映出牛奶中蛋白酶的活 力，结果之间可以进行比较客观的比较。

3 结 论

试验对福林法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法 这3种测定牛奶中蛋白酶活力的方法进行比较， 从相 关性结果来看，3种方法均能从不同角度反映出牛奶 中蛋白酶活力。 福林法虽然操作复杂，但其测定结果 能够直接客观的反应出牛奶中蛋白酶活力， 精确度、 准确度和灵敏度高，重复实验结果的重现性好，适合 于牛奶中蛋白酶活力的精密测定；邻苯二甲醛衍生比 色法测定的蛋白酶活力是以1 L牛奶中游离氨态氮的 毫摩数来表示，精确度和准确度好，灵敏度高，反应时 间短， 但测定过程中由温度引起的SDS溶解性问题对 测定结果影响较大，适合于不同样品间蛋白酶活力的 精确比较；甲醛法是以100 mL牛奶中氨基酸态氮的质 量来表征蛋白酶活力的，操作简单，但是准确性和精 确度都较低，重复实验时结果的重现性不好，适合于 粗略性和比较性测定。

参 考 文 献：

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[2] 闫志国. UHT乳生产工艺及其在贮藏期间理化性质的变化[J]. 乳业 科学与技术，2011

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[3] 于维军，王瑞强，赵庆江. 超高温灭菌乳的主要质量问题及控制措施 [J]. 中国乳品工

业，2006，34(6)：55-57.

[4] 付文菊. 嗜冷菌及其耐热性酶对乳制品品质的影响[J]. 农产品加工， 2009(9)：78-80.

[5] 王辉，吕加平，刘鹭. 耐热蛋白酶对UHT乳蛋白的水解作用[J]. 食品 科学，2010，31(17)：228-231.

[6] 李存富. 酱曲蛋白酶活力测定-氨基氮法[J]. 中国调味品，2006(3)： 4849.

[7] 鲁红侠，杜先锋，陈文帮，等. 糙米发芽过程中蛋白酶活力动态变化 研究[J]. 食品工业科技，2013，34(10)：272-276.

[8] 吴辉，卓林霞，解检清，等. 发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的 蛋白酶活力的影响[J]. 现代食品科技，2008，24(10)：973-976.

[9] 康小红，孙国庆，付治军，等. UHT牛奶蛋白凝块产生原因及控制措 施的研究[J]. 食品工业科技，2008，29(5)：165-167．

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[13] 郑玉才. 加热和磁处理对牛奶中酶活力及蛋白组成的影响 [J]. 中国乳品工业，1994，22(4)：171-172.

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篇五：实验报告-从牛奶中分离酪蛋白

实验报告

一、 实验名称：从牛奶中分离酪蛋白

二、 实验目的：

1. 学习从胶体中提取某一类物质的方法。

2. 学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。

三、 实验原理：

1. 蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。

2. 缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。

3. 蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。

4. 茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。

四、 实验步骤及现象：

1. 取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。

2. 继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心15min。

3. 离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。

4. 将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。

5. 称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。

五、 实验数据：

空表面皿的质量m0 =28.15g

表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g

牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g

六、 讨论与感想：

1. 牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的

2.

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7. 等电点，从而可以使最多的酪蛋白沉淀析出。 加入的醋酸不能过量，过量酸会促使牛奶中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，难以将酪蛋白分离。 析出的酪蛋白沉淀是絮状物，直接过滤会堵塞漏斗孔，所以要先对悬浊液进行离心操作，使得絮状物富集，便于过滤。 用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀的原因是因为酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，而脂质溶于其中，可以用来洗涤除去酪蛋白粗制品中的脂质。 理论上最终得到的酪蛋白应该是纯白色的，但是实际得到的酪蛋白表面会有一些黄色物质，这些黄色物质是没有洗净的残留脂质。其原因可能是在用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀的时候，没有充分搅拌，使得洗涤不彻底。 通过查找资料得知，蛋白质的颜色反应是不同物质与蛋白质中的特定结构（例如肽键、苯环、氨基酸等）的反应，因为反应能产生特定的颜色，所以可以用来鉴定蛋白质。但是也要注意，颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定性和定量测定的依据。 离心仪是本次实验中第一次接触到的器械，它的使用也有注意事项：处于相对位置

的两个离心杯要保证质量相同，因为高速转动需要很大的向心力，如果相对位置的两个离心杯质量不同，会使得转轴受力不均匀，可能导致转轴弯曲。所以，在放入离心机之前，要用天平比较两个离心杯和其中液体的质量，并进行适当调整。

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