作业帮分子生物学方面的,设计一组实验克隆一个你感兴趣的人类基因,并对基因产物大量表达与纯化
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/08 07:56:55
分子生物学方面的,设计一组实验克隆一个你感兴趣的人类基因,并对基因产物大量表达与纯化
分子生物学方面的,
设计一组实验克隆一个你感兴趣的人类基因,并对基因产物大量表达与纯化
分子生物学方面的,设计一组实验克隆一个你感兴趣的人类基因,并对基因产物大量表达与纯化
使用基因工程手段,将目的基因运用PCR技术将其P出之后,然后构建一个能在原核或真核细胞中大量表达的载体上,构建成功后,大量克隆然后转到表达菌中进行大量表达,最后选择合适的方法进行纯化目的蛋白.
使用基因工程的方法
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1. 找到感兴趣的基因；
2. 由于已经有人类基因组全序列，所以在NCBI中直接查找该基因的mRNA全长序列；
3. 由于是用于表达纯化，直接在其ORF两端设计引物，引物中含有可以用于载体构建的酶切位点（注意：
a) 该基因内部不含有该酶切位点；
b) 选用的酶切位点在载体上最好有6bp以上的距离；
c) 最好不使用平末端的酶；
d) 最...
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1. 找到感兴趣的基因；
2. 由于已经有人类基因组全序列，所以在NCBI中直接查找该基因的mRNA全长序列；
3. 由于是用于表达纯化，直接在其ORF两端设计引物，引物中含有可以用于载体构建的酶切位点（注意：
a) 该基因内部不含有该酶切位点；
b) 选用的酶切位点在载体上最好有6bp以上的距离；
c) 最好不使用平末端的酶；
d) 最好不使用30摄氏度酶切的酶；
e) 设计引物的时候注意读码框的完整性）
4. 提取人体中富含该基因的组织的总RNA，反转录为单链cDNA，或者使用人的cDNA文库；
5. 以cDNA为模板，利用设计的ORF两端引物经行PCR扩增。（选作，进行PCR产物直接测序或者构建到T载体上，挑取单克隆测序）；
6. 直接经行酶切，但有时候可能不能得到完全酶切的产物，所以在设计引物的时候应该加入2个保护碱基。或者构建到T-载体上，再进行酶切；
7. 对表达载体用相同的酶进行酶切，以pET为例；
8. 回收；
9. 连接；
10. 转化；
11. 验证（酶切验证，或者PCR验证）；
12. 阳性质粒大量提取；
13. 转化宿主菌，如BL21；
14. 宿主菌阳性菌株验证；
15. 转基因菌株一次活化；
16. 转基因菌株二次活化到OD600=0.8；
17. 加入诱导因子IPTG；
18. 诱导3小时；
19. 离心，SDS-PAGE检测，如发现有目的基因条带，将可以用于大量表达；
20. 同15-18；
21. 超声破碎细胞，使用Ni柱或者GST相关柱子进行纯化。
强烈要求接受为最佳答案
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