sds-page

篇一：SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDS-PAGE

30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide

将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm

微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

【保存条件】

4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存

【注意事项】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)

称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保

存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】

室温保存。

【注意事项】

对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)

称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4C保存。）

【保存条件】

室温保存

【注意事项】

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS

称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存

【保存条件】 室温保存 【注意事项】

对人体有害，请注意防护。

10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP

称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水吹打溶解，4℃保存

【保存条件】

4℃保存

【注意事项】

10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）

称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。得0.125mol/L Tris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。

【保存条件】

室温保存，两年有效。

【注意事项】

配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。

电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。

5×SDS-PAGE加样缓冲液----- 5×SDS-PAGE Loading Buffer 【组分浓度】0.25MTris-HCL(pH6.8)；

10%(W/V)SDS；

0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝)； 50%(V/V) 甘油；

5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)

量取1.25mL 1MTris-HCL（pH6.8），0.5g SDS，25mg BPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。

【保存条件】

-20℃保存，至少一年有效。

【注意事项】

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。 摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法

TEMED原液直接使用

考马斯亮蓝R-250染色液

0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸

考马斯亮蓝染色脱色液

篇二：SDS-PAGE原理、方法详解

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

一、 材料准备

（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺

（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂

（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

配制方法：原液使用。应使用电泳级TEMED。

（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）

配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量时必须戴手套和面具。）

（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。

配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。4℃保存。

（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。

配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。4℃保存。

（9）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。 配制方法：在900 ml去离子水中溶解15.1g Tris和94 g甘氨酸（电泳级）（pH8.0），然后加入50 ml 10% SDS（电泳级）或5g SDS，用去离子水补至1000 ml。

（10）1×SDS样品缓冲液：50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％（m/v）SDS，0.1％（m/v）溴酚蓝，10%（v/v）甘油。不含DTT的1×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。（5×SDS样品缓冲液：250mM Tris-HCl (pH6.8)，500mM DTT，10％ (m/v) SDS，0.5％(m/v) 溴酚蓝，50%（v/v）甘油。不含DTT的5×SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。）

（11）考马斯亮蓝染色液：将0.25 g考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250溶解在90ml甲醇：水（1:1，v/v）和10ml冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。

（12）脱色液

配制方法：90ml甲醇：水（1:1）溶液和10ml冰醋酸的混合液。

（13）蛋白质分子量标准物（marker）

二、 原理

三、 步骤

（1） 按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。

（2） 装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。

（3） 确定凝胶浓度体积，按附注1.配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯中。

（4） 小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到距短玻璃板顶端约3cm处。

注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）

（5） 轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合

的抑制作用。

（6） 分离胶充分聚合。时间约30~60min，聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。

（7） 倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。

（8） 按附注2.配制5%浓缩胶，并注入分离胶上端，插入梳子。插入梳子时要小心避免梳子顶端

留有气泡。

（9） 浓缩胶充分聚合，时间30~60min。

（10） 浓缩胶聚合好后，将制胶装置从基座上取下，放如电泳槽中。

（11） 上下槽均加入新鲜Tris-甘氨酸电极缓冲液（至少负极槽使用新鲜电泳缓冲液）。

（12） 小心拔出梳子，若孔间隔离凝胶条倾斜，用小号注射器针头扶正。

（13） 用电泳缓冲液冲洗梳孔。

（14） 样品准备：样品中加入50~100μl 1×SDS样品缓冲液使之溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，

并沸水浴3~5min，室温下冷却。同样准备蛋白质分子量标准物。

（15） 上样。用微量注射器小心将15μl蛋白样品加到样品槽底部。电极缓冲液为Tris-甘氨酸

电泳缓冲液。留一孔加Marker。加样时间要尽量短，避免样品扩散及边缘效应。

（16） 电泳。开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电

泳，直到溴芬蓝染料带抵达分离胶底部1cm距离，断开电源。

（17） 染色。取下凝胶，用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢旋转4h

以上。回收染色液。

（18） 脱色：将凝胶浸泡在脱色液中，缓慢摇动4~8小时脱色。其间换脱色液3~4次。直到脱色充

分。

（19） 用凝胶成像系统在白屏上进行照相记录。也可将凝胶装入盛有20％甘油水溶液的塑料袋中，

封闭保存。还可以将凝胶干燥成胶片保存。

附注：

1、 Tris-甘氨酸SDS-PAGE分离胶配方

2、 Tris甘氨酸SDS-PAGE浓缩胶配方

3、

篇三：SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）

3.程序：

3.1. 制胶

3.1.1组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下

端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置

梳齿下缘约1cm)。

3.1．2.3液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面

变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，

并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置

3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：

3.1.3.2插入制胶梳

混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳

3.2.1 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹

形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，

其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理 对于蛋白样品直接取80μl的样品，依次加上20μl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样 用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加

入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳 将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶 把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，

完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

3.5.拍照 将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到

扫描仪上，拍照。

4. 注意事项

4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；

30KD-10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。

4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。

操作步骤：

采用垂直式电泳槽装置

1、 安装电泳槽

2、 配制分离胶(12%)（10ml）：

混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。（凝胶完全聚合需30-60min）。

3、 配制积层胶（5%）（3ml）：

将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。

5、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min， 12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。

6、上样：取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。

7、电泳：在电泳槽中加入1?电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需2-3h）。

8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。

9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

注意事项：

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

周师姐 试剂配制：

? 30%丙烯酰胺(29:1)配制：称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶

解。加去离子水将溶液定容至100 mL，用0.45um滤膜滤去杂质，于中4℃避光保存。

? 5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800

mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。

? 10 %过硫酸胺(AP)的配制：称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 ℃避光保

存，保存时间不能超过1周。

? 10 % SDS的配制：称取SDS 10 g溶于100 mL灭菌的去离子水中并于50℃水浴下溶解，室温保存。如在长

期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

? 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至

8.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。

? 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)：称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至

6.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。

? 12 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺4 mL、去离子水3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP

100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。

? 15 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺5 mL、去离子水2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP

100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。

? 5 % SDS-PAGE 浓胶：30%丙烯酰胺0.5 mL、去离子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP

30 μL、10 % SDS 30 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。

? 考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯

中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。

? 脱色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶至1L，搅拌均匀，室温保存备用。

? 转移缓冲液的配制：称取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；加入100 mL

甲醇，最后用去离子水定容至500 mL，室温下保存备用。

? 洗膜缓冲液(TBST)的配制：称取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌

溶解；用1 M HCl将溶液的pH值调至7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混匀；加去离子水将溶液定容至1 L后，于4 ℃保存备用。

? 封闭缓冲液的配制：称取0.5 g脱脂奶粉溶于10 mL TBST缓冲液中，充分混匀后备用。

0.1 M 甘氨酸缓冲液配制：称取0.75 g甘氨酸加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至2.5，用去离子水定容至100mL后用0.22 μm 微孔虑膜过滤除菌后，将其分装并于4 ℃保存备用。

? 1 M Tris-HCl 缓冲液的配制：称取12.1g Tris-base，加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至

7.5，用去离子水定容至100mL备用。

? 银染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。

? 银染氧化液：称取0.7 g高碘酸溶于100 mL去离子水，充分混匀备用。

? 银染显色液：浓度为0.005 g/L的柠檬酸，0.02 %的甲醛。

? 银氨溶液：浓度为0.67 % 的硝酸银，0.33 %的氨水，0.8 g/L的NaOH。

篇四：SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作规程

1、目的

建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。

2.范围与职责

适用SDS-PAGE电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA检查员、生产主管负责监督。

3.程序：

3.1. 制胶

3.1.1组装胶架

将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置

3.1.2.1 10%分离胶配方如下表：

3.1.2.2 灌胶

混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。

3.1．2.3液封

在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶

面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的

胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上

层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置

3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：

3.1.3.2插入制胶梳

混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳

3.2.1 安装电泳槽

将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理

对于蛋白样品直接取80μl的样品，依次加上20μl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样

用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳

将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶

把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色

放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

3.4.脱色

取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

3.5.拍照

将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。

4. 注意事项

4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD

选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD-10KD选用15%胶。

4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头

或清洗吸头后再点另一个样品。

4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。

4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。

4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。

4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。

4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。

4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很

慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。

5. 异常情况处理：

操作过程中设备发生不正常或故障时，应及时告知负责人，及时处理。

篇五：SDS-PAGE原理及常见问题

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：

Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？

A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q：样品如何处理？

A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；

TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；

十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

Q：为什么带出现拖尾现象？

A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

Q：为什么带出现纹理现象？

A：主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

Q：什么是“鬼带”，如何处理？

A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

Q：为什么电泳的条带很粗？

A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

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