cst抗体官网

篇一：CST抗体

我参考的抗体有下面几种

1. Bax, western用，当然能做免疫组化更好，不知道两者兼顾的是不是更贵一点，CST的网站上有这几种，

No.

No. Name Name Applications Applications Reactivity Reactivity 5023 Bax (D2E11) Rabbit mAb W IP IHC-P H

2772 Bax Antibody W IP H M R Mk 2774 Bax Antibody (Human Specific) W IP IHC-P H Mk

不知道后面的那个reactivity是什么意思，我做的是人的胃癌细胞株跟白血病细胞株。

2.Bcl-2,跟前面一样的要求。

2870 Bcl-2 (50E3) Rabbit mAb W IP H M R (Mk) (C) (B) (Dg) 3498 Bcl-2 (D17C4) Rabbit mAb (Mouse Preferred) W IP H M

4223 Bcl-2 (D55G8) Rabbit mAb (Human Specific) W IP H

2876 Bcl-2 Antibody W H M R

2872 Bcl-2 Antibody (Human Specific) W H

这几种后面的mouse prefered跟human specific是什么意思。 3.actin，western用

4970 β-Actin (13E5) Rabbit mAb W IHC-P IHC-F

IF-IC F H M R Mk B Pg (C) (Dg) (Hr)

5057 β-Actin (13E5) Rabbit mAb

(Biotinylated) W F H M R Mk B Pg (C) (Hr)

5125 β-Actin (13E5) Rabbit mAb

(HRP Conjugate) W H M R Mk B Pg (C) (Hr)

8457 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb W IF-IC H M R Mk

3700 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb W IHC-P IF-IC

F H M R Hm Mk

4967 β-Actin Antibody W H M R Hm Mk Mi Dm Z B (C)

(X) (Dg) (Pg) (Hr)

Actin主要看报价哪个便宜并且稳定一点，如果有推荐的更好。不一定非得CST公司的，其他的内参也可以。

篇二：cell signaling technology(CST)常见问题回答

Cell Signaling Technology（CST） 常见问题回答（FAQ）

1. 问:如何储存 CST 的抗体?

答:请将抗体的原始管储存到 -20°C,不要分装。因为抗体储存在含有 50% 甘油的缓冲液中,所以抗体在 -20°C仍为液体状态,不会因为反复冻融而降解。具体储存温度请参考产品说明书。

2. 问:如何储存 SDS 裂解的磷酸化蛋白样本?

答:如果短期内使用 ( 少于 3 个月 ),SDS 样本细胞裂解液可以储存在 -20°C,如果长期储存,应保存于 -80°C。活化的蛋白样本的降解变化很大,其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化的蛋白。

3. 问:能用室温孵育抗体 1 小时代替 4°C过夜吗?

答:不建议。CST 公司活化状态的特异性抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基。这些修饰包括磷酸化,乙酰化和酶切割。与识别总蛋白的抗体相比,大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的亲和性。因此,通过 4°C孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的信噪比是非常关键的。

4. 问:当我准备细胞裂解液样品时,需使用什么缓冲液?

答:请检查每个产品说明书中包含的 Western blot 操作步骤中推荐的缓冲液。CST 提供以下缓冲液 ( 见下表 ),或者,如果你想自己配制,CST 网站上列出了特别的缓冲液组分。CHAPS 缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计,适应于 Caspase 的检测,但并非关键。

5. 问:CST 的抗体是否适用于全组织样本裂解物?

答:CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物,但是 CST 的很多抗体已经被其他客户用于整个组织而且取得成功。

6. 问:如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照?

答:请参考 CST 网站上该产品的 Western blot 图,使用图述的细胞系和药物处理,能够得到阳性对照蛋白。也可参见:www.cellsignal.com/support/controls.html 查阅。

7. 问:假如说明书上某个种属未被列出与 CST 抗体有交叉反应,是否意味着这个种属未被检测过呢?

答:如果可能的话,CST 科学家检测所有 CST 抗体在人、小鼠和大鼠的交叉反应性。假如我们没有获得某个种属的阳性结果,我们就不会列出这个种属。然而,有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水平的特定蛋白,或者,我们使用的操作对于那个特定的细胞系不起作用。因此,我们建议你比较所研究种属和 CST 抗体验证种属修饰位点附近的肽段序列 ( 每边 5 个氨基酸 )。在很多情况下,CST 抗体由免疫人的蛋白序列产生,并通过亲和层析高度纯化。很多时候,如果序列相同,或者在非磷酸化位点只有 1 或者 2 个氨基酸的不同时,CST 抗体很有可能识别你的蛋白。

8. 问:使用 CST 抗体时,为什么我不能使用我自己实验室的 Western blot 操作流程? 答:CST 抗体经过优化以提供最强的信号,最少的背景,使用 CST 推荐的 Western blot 操作流程,对于终端客户的优点是节约时间和材料。

9. 问:为什么这个抗体用于 Western blot 效果不佳?

答:这里有几个关于 CST Western blot 流程的细节,对于避免丢失信号或高背景是非常关键的。

? 不要过度清洗膜。应在 TBS/0.1% Tween-20 中清洗三次,每次 5 分钟。过度的清洗会洗掉一抗。推荐的清洗条件已经过优化以获得最好的信噪比,因此是最强、最干净的结果。

? 不要过度封闭 ( 例如超过 1 小时或者过夜 )。在一些抗体中发现,过度封闭会减少特异信号。确保查阅每个产品的说明书以得到每个抗体推荐的封闭时间。

? 一般来说,针对兔多抗或兔单抗,使用抗兔二抗:#7074;针对鼠单抗,使用抗鼠二抗:#7076。但是,请依然检查 www.cellsignal.com 上的产品说明书。

? 确认抗体的说明书上交叉反应部分有列出你所检测的种属。

? 确认你的上样量达到 20 μg 细胞裂解液。

? 确认诱导的细胞裂解液样本蛋白已活化。

10. 问:如何确保 Western blot 结果的可重复性?答:至于为什么看起来较难重复 Western blot 结果,这里有几种可能性。要发现这种情况的原因,可考虑以下:

? 你是如何储存抗体的?请参考问题 1,2。

? 抗体稀释后不能重复使用。许多抗体有一个非常低的工作浓度,很可能这个浓度随着连续的 Western blot 会减少。? 你确定你的样本中包含活化的蛋白?细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量,药物诱导时间,细胞传代数量和储存条件不同而改变。

? CST 产品在其保质期内都有最佳表现。请访问 www.cellsignal.com/support/shelflife.html 产 品 保 质 期 页 面 获 得 列表。请注意:不能分装抗体。

11. 问:如何使用固相抗体来做免疫沉淀?

答:要得到最佳的结果,获得均匀的微珠悬浮液是重要的。以下步骤可确保同质:

? 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶 10 分钟。

? 倒置管子几次以获得 50% 微珠 - 缓冲液悬浮液。

? 假如可能,温和漩涡管子。

? 为了迅速吸出产品,切掉吸管端头,将吸管端头插入微珠悬浮液使靠近固相抗体微珠混合物。孵育抗体和 200μg的细胞裂解物 ( 约 1mg/ml)4°C过夜,用推荐的抗体稀释浓度。

12. 问:这个抗体可用于免疫组化吗 ?

答:检测抗体是否可用于福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE) 样 本, 是CST 的一项常规检测。那些通过严格验证标准的抗体才会被推荐用作 IHC-P。我们也在新鲜冰冻组织样本上检测抗体,那些染色成功的才会被推荐用作 IHC-F。那些推荐应用里面没有列出 IHC-P 或者 IHC-F 的,可能已经失败,或者没有被检测,或者我们没有用作检测的特别的组织样本。建议你联系 CST,我们可能有该抗体在其它系统表现良好的数据。或者,我们可能有适用于组织染色的更好的其它产品。

13. 问:这个抗体可用于免疫荧光吗?

答:CST 科学家在很多情况下已经检测所有抗体用于免疫细胞化学,在有的情况下,用于免疫荧光。最终结果在产品说明书和网站上,或者通过 tech@cst-c.com.cn 与技术支持交流以获得更多细节。

14.问:CST 如何确保抗体的质量?

答:CST 科学家努力检测所有产品的主要应用如免疫印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组化和 ELISA。我们也常规检测我们的抗体在不同物种上的应用,包括人、小鼠、大鼠。在 CST,产品的高质量是我们最关心的。我们不断地检测产品的新应用,如果你对说明书上未列出的某个特定的应用感兴趣,请联系 CST 技术支持 tech@cst-c.com.cn 以获得最新应用的更新或者其它帮助。

15. 问:CST 如何对不同的批次进行质量控制?

答:CST 科学家努力达到每批产品的一致性或效果更佳。作为标准,我们在新的批次中检测以往批次中的所有应用。每个批次每个应用推荐的浓度都经过优化,所以请遵循我们的操作步骤。有时候,批次抗体的浓度被调整以获得更好的结果。

16. 问:我订购的抗体可以不含 BSA 或甘油吗?

答:对于大宗订单,许多抗体都可以根据客户的特殊需求而定制

篇三：CST常见问题与回答(最新版FAQ)

CST常见问题与回答（最新版本）

1、我该如何储存我的抗体？多高的温度会影响抗体的稳定性？答：请将抗体的原始管储存到-20°C，不要分装，否则有可能引

起抗体的改变和浪费。提供的抗体贮存在包含50%甘油缓冲液中，

在推荐的储存温度下不会冷冻。这避免了由于反复冻融导致的抗体

降解。偶联抗体可能储存在4°C，请参照产品说明书上的建议储

存。

2、如何储存SDS 裂解的磷酸化蛋白样本？

答：如果短期内使用( 少于3 个月)，SDS 样本细胞裂解液可以储存在-20℃，如果长期储

存，应保存于-80℃。活化的蛋白样本的降解变化很大，其降解率取决于每种蛋白的性质和

样本里究竟含有多少活化的蛋白。

3、能用室?a href="http://www.zw2.cn/zhuanti/guanyuluzuowen/" target="_blank" class="keylink">路跤固? 小时代替4℃过夜吗？

答：不建议。CST 公司活化特异的抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基。这些

修饰包括磷酸化，乙酰化和酶切割。与识别总蛋白的抗体相比，大多数针对这些修饰位点的

抗体具有较低的亲和性。因此，通过4℃孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的

信噪比是非常关键的。

4、当我准备细胞裂解液样品时，需使用什么缓冲液？

答：请检查每个产品说明书中包含的Western blot 操作步骤中推荐的缓冲液。CST 提供

以下缓冲液( 见下表)，或者，如果你想自己配制，CST 网站上列出了特别的缓冲液组分。

CHAPS 缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计，适应于Caspase 的检测，但并非关键。 样本处理

全细胞裂解物，使用标准

的SDS-PAGE 上样缓冲液

#7722 或#7723

免疫沉淀和/ 或激酶分析，

使用#9803

切割的半胱天冬酶和其底

物的免疫印迹，使用#9852 推荐使用缓冲液 蓝色的上样缓冲液包装 #7722 或红色的上样缓冲液 包装#7723 细胞裂解缓冲液(10X) #9803 CHAPS 缓冲液(10X) #9852

5、CST 的抗体是否适用于全组织样本裂解物？

答：CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物，但是CST 的很多抗体已经被其

他客户用于整个组织而且取得巨大成功。

优宁维微信公众号：优宁维抗体专家/UNIVSUBC

6、如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照？

答：请参考CST 网站上该产品的Western blot 图，使用图述的细胞系和药物处理，能够

得到阳性对照蛋白。也可参见：www.cellsignal.com/support/controls.html 查阅

7、假如说明书上某个种属未被列出与CST抗体有交叉反应，是否意味着这个种属未被检测

过呢？

答：可能未被检测过。CST科学家检测所有CST抗体在多个物种的交叉反应性，如果可能

的话（这个依赖于目标蛋白和实验系统的可行性）。假如我们没有获得某个种属的交叉反应

的阳性结果，我们就不会列出这个种属。然而，有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水

平的特定蛋白，或者，我们使用的诱导条件对那个特定的细胞系不起作用。如果您需要针对

某个种属交叉反应的更多信息，请随时联系我们的技术支持团队support@cellsignal.com

或者优宁维公司来获取帮助。

8、使用CST抗体时，为什么我不能使用我们自己实验室的免疫印迹操作流程？

答：CST?抗体经过优化以提供最强的信号，最少的背景，使用CST推荐的免疫印迹操作

流程，对于终端客户的优点是节约时间和材料。

9、如何确保Western blot 结果的可重复性？

答：至于为什么看起来较难重复Western blot 结果，这里有几种可能性。要发现这种情

况的原因，可考虑以下：

9-1）你是如何储存抗体的？请参考问题1，2。

抗体稀释后不能重复使用。许多抗体有一个非常低的工作浓度，很可能这个浓度

随着连续的Western blot 会减少。

9-2）你确定你的样本中包含活化的蛋白？细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞

数量，药物诱导时间，细胞传代数量和储存条件不同而改变。

CST 产品在其保质期内都有最佳表现。请访问

www.cellsignal.com/support/shelflife.html 产品保质期页面获得列表。请注意：不能分

装抗体。

10、如何使用固相抗体来做免疫沉淀？

答：要得到最佳的结果，获得均匀的微珠悬浮液是重要的。以下步骤可确保同质：

? 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶10 分钟。

? 倒臵管子几次以获得50% 微珠- 缓冲液悬浮液。

? 假如可能，温和漩涡管子。

? 为了迅速吸出产品，切掉吸管端头，将吸管端头插入微珠悬浮液使靠近固相抗体

微珠混合物。孵育抗体和200μg的细胞裂解物( 约1mg/ml)4℃过夜，用推荐的抗体稀释

浓度。

11、当有多种抗体可以选择时，哪一种在我的实验中表现最优？

答：通常，CST会针对一个目标蛋白提供多个抗体。选择在您接下来的实验中表现最优的

抗体，可以访问抗体对照表格或者联系CST技术支持support@cellsignal.com或优宁维

公司来获取帮助，进而选择最适合您实验的最优抗体。

12、CST如何确保抗体的质量？

答：CST科学家努力检测所有产品的主要应用，例如免疫印迹，免疫沉淀，免疫荧光，免

疫组织化学，流式细胞术，和染色质免疫沉淀。当一个抗体被推荐用来某个特定的应用，说

明这个抗体已经通过了严格的特异性实验测试的标准。此外，我们的科学家针对每个产品创

建了专门的（优化的）免疫染色的方法，为您节约时间和试剂。我们也常规检测我们的抗体

在不同物种的应用，包括人类，猴子，小鼠和大鼠。产品的高质量是CST最关心的。如果

您对某个没有在产品页面列出的某个特定的应用感兴趣，请联系CST技术支持support@cellsignal.com，来获取更多的信息。

13、对于不同的批次，CST如何对质量进行控制？ 答：CST 科学家努力达到每批产品的一致性。作为标准，我们在新的批次中检测以往批次

的所有应用。每个批次每个应用推荐的浓度都经过优化，所以请遵循我们的操作步骤。您可

以浏览我们的免疫印迹验证页面获取更多知识。

14、我能够订购一个定制配方的抗体吗？

答：针对客户（不含载体）的订单，许多制备在不含BSA或甘油的PBS中的抗体都有库存。

这个配方可以为了偶联而更改，能够连接到荧光素，微珠，或者染料。为了满足您分析的需

要或者您实验室的需要，我们也很高兴向您整批出售。关于价格和可用性的问题，您可以联

系我们info@cst-c.com.cn或者优宁维公司。

15、CST能够定制我的抗体吗？

答：CST不会开发定制抗体，但是我们很高兴接受您的目标蛋白抗体建议。请发送您的建

议到info@cst-c.com.cn，CST科学家将在短期之内联系您。

16、为什么我们的抗体能够在常温下运输？

答：与CST在环境方面的巨大努力一致，我们从2003年开始，在常温下运输抗体，尽可

能的减少包装材料的浪费。每个CST?抗体都需经过稳定性检测，先在常温和37°C下放

臵一周，然后进行免疫印迹测试以确保抗体的性能没有改变。如果你收到的抗体保存在常温

中，请放心它已经通过稳定性测试，抗体的性能仍然是最优的。抗体接收后，请按照产品说

明书中的推荐温度储存。

17、这个抗体是否做够做这些实验（免疫印迹，免疫沉淀，免疫荧光，免疫组织化学，流式细胞术，染色体免疫沉淀）？

答：CST会例行在相关的实验中测试抗体。这些被推荐的应用，都通过了严格的应用特定的验证标准。我们仅会推荐通过严格验证标准的应用，如果这个实验数据是模棱两可的，我们是不会推荐这个应用的。关于某个特定的抗体的更多信息或者咨询哪种抗体将在您的实验中表现最佳，可以联系CST的技术支持团队 support@cellsignal.com或优宁维共公司。

18、这个抗体能否用来做荧光免疫印迹？

答：CS并没有对抗体是否能够做荧光免疫印迹进行常规测试，尽管在这个实验中许多抗体是发挥作用的。使用CST的抗体做荧光免疫印迹时，需要使用经修改过的免疫印迹的操作流程。我们发现去除封闭步骤中的Tween? 20去污剂（在TBS中只使用5%的脱脂奶粉）和在显影前干燥膜是针对标准流程做出的仅有的必要改变。详细信息能够在荧光Western免疫印迹操作步骤（一抗用BSA孵育）和荧光Western免疫印迹操作步骤（一抗用牛奶孵育）中找到。另外，Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720在近红外波段中具有自发荧光。

19、我的抗体的浓度是多少？

答：在CST，我们依据抗体活性来制备抗体，会为您做出调整。为了达到最优的效果，不同批次抗体的浓度有时会做出调整。咨询特定批次抗体的浓度，请联系CST中国技术支持：tech@cst-c.com.cn或 优宁维公司。

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篇四：CST公司价目表

篇五：Western Blot流程(自CST网站及《精编分子生物学实验指南》)

一、 基本原理、分类

二、 流程：（自CST网站）

三、 流程：（自《精编分子生物学实验指南》）

Western Blot是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体进行检测。对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测

Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。

原理

Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

分类

Western Blot显色的方法主要有以下几种：

i. 放射自显影

ii. 底物化学发光ECL

iii. 底物荧光ECF

iv. 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

[编辑本段]其他

值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。

BSA) <录自CST网站>

For Western blots, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween-20 at 4°C with gentle shaking, overnight.

Products available from Cell Signaling Technology are linked by their respective catalog numbers.

A. Solutions and Reagents

NOTE: Prepare solutions with Milli-Q or equivalently purified water.

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS).

2. 1X SDS Sample Buffer: (#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25°C), 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT, 0.01% w/v bromophenol blue or phenol red.

3. Transfer Buffer: 25 mM Tris base, 0.2 M glycine, 20% methanol (pH 8.5).

4. 10X Tris Buffered Saline (TBS): (#9997) To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).

5. Nonfat Dry Milk: (#9999) (weight to volume [w/v]).

6. Blocking Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk; for 150 ml, add 15 ml 10X TBS to 135 ml water, mix. Add 7.5 g nonfat dry milk and mix well. While stirring, add 0.15 ml Tween-20 (100%).

7. Wash Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T).

8. Bovine Serum Albumin (BSA): (#9998).

9. Primary Antibody Dilution Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% BSA; for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 μl Tween-20 (100%).

10. Phototope?-HRP Western Blot Detection System: (#7071 anti-rabbit) or (#7072 anti-mouse) Includes biotinylated protein ladder, secondary (#7074 anti-rabbit) or (#7076 anti-mouse) antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP), anti-biotin antibody conjugated to HRP, LumiGLO? chemiluminescent reagent and peroxide.

11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format): (#7720).

12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack: (#7727).

13. Blotting Membrane: This protocol has been optimized for nitrocellulose membranes,

which CST recommends. PVDF membranes may also be used.

B. Protein Blotting

A general protocol for sample preparation is described below.

1. Treat cells by adding fresh media containing regulator for desired time.

2. Aspirate media from cultures; wash cells with 1X PBS; aspirate.

3. Lyse cells by adding 1X SDS sample buffer (100 μl per well of 6-well plate or 500 μl per

plate of 10 cm diameter plate). Immediately scrape the cells off the plate and transfer the extract to a microcentrifuge tube. Keep on ice.

4. Sonicate for 10–15 seconds for complete cell lysis and to shear DNA (to reduce sample

viscosity).

5. Heat a 20 μl sample to 95–100°C for 5 minutes; cool on ice.

6. Microcentrifuge for 5 minutes.

7. Load 20 μl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm). NOTE: CST recommends loading

prestained molecular weight markers (#7720, 10 μl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 μl/lane) to determine molecular weights.

8. Electrotransfer to nitrocellulose or PVDF membrane.

C. Membrane Blocking and Antibody Incubations

NOTE: Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) of membrane; for different sized membranes, adjust volumes accordingly.

1. (Optional) After transfer, wash nitrocellulose membrane with 25 ml TBS for 5 minutes at

room temperature.

2. Incubate membrane in 25 ml of blocking buffer for 1 hour at room temperature.

3. Wash three times for 5 minutes each with 15 ml of TBS/T.

4. Incubate membrane and primary antibody (at the appropriate dilution) in 10 ml primary C.

5. Wash three times for 5 minutes each with 15 ml of TBS/T.

I. For Unconjugated Primary Antibodies

1. Incubate membrane with appropriate HRP-conjugated secondary antibody (1:2000)

and HRP-conjugated anti-biotin antibody (1:1000) to detect biotinylated protein markers in 10 ml of blocking buffer with gentle agitation for 1 hour at room

temperature.

2. Wash three times for 5 minutes each with 15 ml of TBS/T.

II. For HRP Conjugated Primary Antibodies

Skip to Detection of Proteins (Step D).

III. For Biotinylated Primary Antibodies

1. Incubate membrane with HRP-Streptavidin (at the appropriate dilution) in milk for one

hour with gentle agitation at room temperature.

2. Wash three times for 5 minutes each with 15 ml of TBS/T.

D. Detection of Proteins

1. Incubate membrane with 10 ml LumiGLO? (0.5 ml 20X LumiGLO?, 0.5 ml 20X Peroxide

and 9.0 ml Milli-Q water) with gentle agitation for 1 minute at room temperature. NOTE: LumiGLO? substrate can be further diluted if signal response is too fast.

2. Drain membrane of excess developing solution (do not let dry), wrap in plastic wrap and

expose to x-ray film. An initial 10-second exposure should indicate the proper exposure time. NOTE: Due to the kinetics of the detection reaction, signal is most intense immediately following LumiGLO? incubation and declines over the following 2 hours.

posted June 2005 revised October 2008

（以下摘自《精编分子生物学实验指南》） 返回

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