overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 06:37:26

overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg
overlap
一、用这对引物
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
A2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag
扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]
已割胶回收,即片段A
二、用这对引物
B1- F：tcttcccggcgccccaatgcgcgcaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatc
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
扩增出B片段,产物长1680bp
已割胶回收,即片段B
三、把一、二步中得到的PCR产物A、B通过overlap PCR连接起来,产物长4200bp左右
使用引物：
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
就在这一步问题出现了,就是这步做了N多次,就是PCR不出目标条带,（每一次pcr产物都会出两个杂带很亮大约一个1100bp,一个1800bp,始终无目标带）
本人使用primestar酶 采用温度梯度(50度至65度)、模板1:1浓度梯度（20ng至200ng）、同时也采用了两步法（68度5分钟或者72度5分钟退火延伸）.也使用过LATAQ酶 PfuUltra IIFusion HS DNA Polymerase 酶.都没扩增出目标条带.
也采用过体系中仅仅不加引物直接跑PCR20个循环,在加入引物在跑30个循环（也这样做过,取该体系中混合液2微升做模板,在重新做一次该PCR）结果还是没有目标条带.
以上PCR全是延伸5分钟,终延伸10分钟.具体的PCR都是按照酶的说明书操作.
本人可以说在实验过程中可以完全不用考虑因实验操作导致失败---这点可以肯定无误!

overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg
亲,仔细看一下,你的B1-F的5‘端是不是多了一个t,或者A2- R的3‘端少了一个A?这两个引物不是完美overlap唉

生物实验就是这样 我都急了两个月我的实验了。。。。

overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg 我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都P出来了现在加入两端的引物,就是扩不出来1000的条带,这20重叠有13个是CG对,我不知道是不是退火温度的 引物后面带上F 是单纯区分引物一和二吗? 对于一段有重复序列的片段如何扩增,只是一个基因的中间的部分序列,准备扩增做overlap.我在两端设计的无配对引物,无法扩增目的条带,不知对PCR 条件有什么要求? 上游引物用英文怎么说引物-R引物-F哪个是上游的哪个是下游的啊? pp5引物设计用PRIMER自动搜索设计的多对引物中,能不能用一对引物的上游与另一对引物的下游配对 请问,我用OVERLAP PCR 合成一小片段我要突变的79bp的基因,需要高保真酶吗?还有就是,我不是将两个基因连起来,而是引物本身也是模板合成我的基因片段. 谁可以简单罗列下做OVERLAP PCR的要点吗?最好图解原理 以及引物设计时候注意事项 为什么扩增用一对引物,而测序要两对引物那为什么不直接用两对引物扩增,然后在拼接 这样不是更准确一点么? 同一基因用两对引物扩增的目的是什么 引物设计,用PRIMER 5 设计引物时,有的mRNA设计出来的引物序列,即使最高分的那对,也有二聚体或交叉,该怎么调整,或怎么设计这种mRNA的引物序列. PCR扩增的正反向引物的长度必须一致吗?在别人的文章里看到两对引物正好是我所需要的,但长度不同,正向引物20个碱基,反向引物是19个,这样的引物可以用吗?对实验有什么影响吗? 引物ITSR/F退火温度是多少?急 荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电 简并引物 设计软件有Fasta格式的比对文件想设计简并引物该用什么软件? 做PCR需要用的引物序列有,但不知道是不是对的,我想测试下,如何测试,另外,有没有公司可以帮忙设计引物的. 我想做细菌pcr后做dgge,我该用什么引物我现在想用引物对f341 和r518 我不知道怎么在上游引物中加GC夹子 GC夹子的序列 简并引物是什么?设计的原则或原理是什么?请用通俗易懂的话来解释一下!明天要答辩了,但对这方面不清楚,