作业帮荧光定PCR中的注意事项关于SYBR Green I荧光定量试验的
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 21:22:39
荧光定PCR中的注意事项关于SYBR Green I荧光定量试验的
荧光定PCR中的注意事项
关于SYBR Green I荧光定量试验的
荧光定PCR中的注意事项关于SYBR Green I荧光定量试验的
影响荧光PCR的因素很多,但从操作和技术上来讲应该要注意一下几点：
1.RNA的完整性
因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量,所得的结果也是错误的.所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范,避免RNA酶的污染.
2.RNA样品中的基因组DNA污染
提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA.基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的特异性.
3.PCR反应体系的优化
PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物,为此,首先要保证PCR反应体系达到最优.目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒,可以方便PCR反应的操作.
4.反转录
反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量,反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步.目前常用的反转录酶有2种：AMV-RT和MMLV-R.反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物.相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR.
5.利用实时定量PCR研究基因表达时,一般用相对定量的方法相对定量必须用到内标基因.可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因.常用的内标基因有β-tublin、actin、
GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等.尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定,但是
最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化.也就是说并不是任何内标基因都适合
任何试验.在选择内标基因时,应仔细考虑各种因素,选择合适的内标基因或内标基因组合.
实验前验证引物的特异性
实验中主要更换手套