DNA提取试剂盒的使用方法

DNA提取试剂盒的使用方法
DNA提取试剂盒的使用方法

DNA提取试剂盒的使用方法
●操作方法
操作流程见图1,全套操作约需1小时,分匀浆、细胞裂解、除蛋白、DNA纯化等步骤,详细说明如下：
1. 匀浆和细胞裂解.
使用不同的实验材料需采用不同的匀浆步骤,具体说明如下：
【从动物组织中提取基因组DNA】
◆使用研钵进行匀浆时：
① 取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中,快速用力展研成匀浆.
注）下列组织请加液氮研磨至粉末状.
A．富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织.
B．富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织.
C．富含角质蛋白的组织或坚硬的组织（如骨骼）等.
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,温和研磨30秒钟.
注）使用上述①-注）的实验材料时,请在加入Solution A及RNase A1后,将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟.
③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至Collection Tube中.如果匀浆体积不足650 μl,请补充Solution A至650 μl,65℃保温5分钟.
◆使用研磨棒进行匀浆时：
① 取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的Collection Tube 中,用研磨棒快速研磨成糊状.
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成匀浆.
③ 加入350 μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入Collection Tube中,充分振荡混合后,65℃保温5分钟.
【从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA】
① 按下表称取适量的新鲜植物材料（如选用的是冷冻干燥植物材料,则用量减半）,剪成小块放入研钵中,加入液氮,待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状.研磨时应间断加入液氮以防止材料融化.
植物材料种类
植物材料使用量*
植物花、叶片
10～100 mg
植物茎
60～240 mg
植物根
80～240 mg
植物种子
80～240 mg
* 如选取植物的根、种子等样品时,因其基因组DNA含量很低,需使用超过表格中所示的参数用量,此时请分两管进行步骤1～6的实验操作,在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一Spin Column中过滤,使各管的基因组DNA结合到同一个Spin Column上.
如从培养的植物细胞中提取基因组DNA,请离心收集2×103～1×107的培养植物细胞,加入150 μl水充分悬浮细胞后移入研钵中,加入液氮后快速、用力研磨至粉末状.
注）样品研磨应充分,否则将会严重影响基因组DNA的收率.
② 将研钵移至65℃水浴,当样品粉末刚开始融化时,向研钵中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1,用力碾磨30秒.
③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆移至Collection Tube中.如匀浆体积不足650 μl,请补充Solution A至650 μl.65℃保温15分钟.
注）处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时,可延长水浴时间至60分钟.
【从全血中提取基因组DNA】
① 取10～250 μl的全血（含抗凝剂）加入至Collection Tube中.
② 加入500 μl的Solution A.
③ 加入1 μl的RNase A1,激烈振荡15秒钟后,冰浴5分钟.
注） 人与动物的抗凝全血的一次处理量为≤250 μl；禽类、两栖类的抗凝全血的一次处理量为≤10 μl.
【从培养细胞中提取基因组DNA】
◆使用悬浮培养的动物细胞时：
① 使用Collection Tube收集1×105～1.5×107的细胞悬浮液,5,000 rpm离心5分钟,弃上清（细胞培养液）.
② 加入150 μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞.
③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1,激烈振荡15秒钟,然后室温静置1分钟.
◆使用贴壁细胞时：
① 弃尽培养液,向培养皿中加入650 μl的Solution A,室温静置1分钟.
注）96孔板等的每个孔中一次容纳不了650 μl 溶液时,请分数次处理细胞.
② 用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞,取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中.
③ 加入0.8 μl的RNase A1,激烈振荡15秒钟,然后室温静置1分钟.
2. 加入400 μl的Solution B,振荡混合.
3. 加入1 ml的4℃预冷的Solution C,充分混匀后,12,000 rpm离心2分钟.
4. 弃去上层有机相,再加入1 ml的4℃预冷的Solution C,充分混匀后,12,000 rpm离心2分钟.
5. 弃去上层有机相,然后将水相溶液（无色下层）转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中,12,000 rpm离心1分钟.
注）有机相（上层）带有颜色,请务必除尽,否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上.相间沉淀不必考虑,在过滤时将被去除.
6. 弃Filter Cup,在滤液中加入400 μl的DB Buffer,混合均匀.
7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上.将上述操作6混合溶液转移至Spin Column中,12,000 rpm离心1分钟,弃滤液.
8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中,12,000 rpm离心30秒钟,弃滤液.
9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中,12,000 rpm离心30秒钟,弃滤液.
注）请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份.
10. 重复操作步骤9.
11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟.
注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率.
12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA.
如果实验室备有适合于Spin Column接口的负压装置,可从上述操作步骤6完成以后进行以下操作.
7. 将试剂盒中的Spin Column插到负压装置的插口上,将上述操作步骤6的混合溶液转移到Spin Column中,开启调节负压装置,缓慢吸走Spin Column中的溶液（流速控制在1滴/秒）.
8. 将负压调至最大,向Spin Column中加入500 μl的Rinse A,吸尽Spin Column中溶液.
9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B,吸尽Spin Column中溶液.
注）请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份.
10. 重复操作步骤9.然后从负压装置上取下Spin Column,将其安置于试剂盒中的Collection Tube上,12, 000 rpm离心1分钟.
11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1分钟.
注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率.
12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA.