使用GYP培养基筛选乳酸菌 ,如何鉴定长出来的是否为乳酸菌?

使用GYP培养基筛选乳酸菌 ,如何鉴定长出来的是否为乳酸菌?
使用GYP培养基筛选乳酸菌 ,如何鉴定长出来的是否为乳酸菌?

使用GYP培养基筛选乳酸菌 ,如何鉴定长出来的是否为乳酸菌?
1.形态和培养特征观察
采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察.染色方法参照微生物鉴定实验指导
2.生长条件试验
(1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0.85 、1.20 和1.71) (mol/ L) ;
(2)耐酸碱试验(p H :4.3 、5.7 、6.8 、8.4 、8.6 和8.7) ;
(3)温度梯度试验(温度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) .
分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况.
3.生理生化试验
⑴过氧化氢酶测定
将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应.
⑵葡萄糖产酸产气实验
在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂,在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h,经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气.
⑶淀粉水解实验
接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全.
⑷明胶液化实验
将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照.将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次.如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应
⑸甲基红（M.R）试验
接种实验细菌于PYG培养基,于37℃培养2天后,于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,表示阳性.
⑹乙酰甲基甲醇V-P实验
接种新鲜的实验菌种于培养基中,37℃培养2天后,取培养液1mL在其中
加入1ml 10％的NaOH,混匀,再加入3－4滴2%氯化铁溶液.数小时后,培养基表面的下层出现红色者,为阳性
⑺柠檬酸盐
取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上,适温培养3－7天,培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应,不变者则为阴性
⑻酪素水解试验
牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶）,另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中,将两液分开灭菌.待冷至45－50℃时,将两液混匀倒平板,即成牛奶平板.将平板倒置过夜,使表面水分干燥,然后将菌种点接在平板上,每皿可点接3－5株菌.适温培养1、3、5天,记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明.配制该培养基时,切勿将牛奶和琼脂混合灭菌,以防牛奶凝固
⑼厌氧生长测定
将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性
(10)厌氧硝酸盐产气
接种封油：以斜面菌种用接种环接种后,用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管,封油的高度约1厘米.必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照.
观察结果：培养2－7d,观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡.如有气泡产生,表示反硝化作用产生氮气,为阳性反应.但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡,则只能按可疑或阴性处理.
(11)石蕊牛奶的反应
牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂.石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白.观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况
(12)糖发酵实验
将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养.检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱.
附一些培养基：
①PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g,MgSO4 20.0g ,K2HPO4 1.0g,,KH2PO4 1.0g,NaHCO3 10.0g,NaCl 2.0g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃)
②PYG培养基:PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖
③营养明胶 蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.7.0；加热溶解、校正至pH7.7.6,分装小管,121℃高压灭菌10min,取出后迅速冷却,使其凝固.复查最终pH应为6.7.0
④柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠 3g NH4H2PO4 1g MgSO4 0.2g
K2HPO4 1g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000mL 加热溶解后,调pH至7,再加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色,分装试管,每管5mL,121灭菌30min
⑤含硝酸钾的营养肉汤 加入2g硝酸钾入营养肉汤
4.16S rDNA 序列分析
5.生长曲线
活菌计数方法：采用涂布法,进行菌落计数,每隔一段时间（2-4小时）测