作业帮不连续SDS-PAGE的原理是什么
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/02 16:27:59
不连续SDS-PAGE的原理是什么
不连续SDS-PAGE的原理是什么
不连续SDS-PAGE的原理是什么
一、原理及目的（略）
二、试剂
1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中,验证其pH值不大于7.0.置棕色瓶中,4℃保存.
2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液
3、10% SDS溶液
4、10%过硫酸铵：新鲜配制
5、TEMED溶液：4℃保存
6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液
7、2×样品溶解液：2%SDS,5%巯基乙醇,10%甘油,0.02%溴酚蓝,0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液.
8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中,含15.1g Tris,94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液.
9、固定液：冰乙酸:甲醇:水=1:2:7
10、考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中,溶解0.25g考马斯亮蓝R,过滤除去未溶物.
11、脱色液：甲醇:水:冰乙酸=9:9:2
注：1、2、5、6、7由教师提供,其余由学生自己配制,其中8可在凝胶凝固的过程中配制,9、10、11在电泳时配制.
三、操作步骤：
1、准备步骤
1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净,然后使其自然风干或烘干.
2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干.
3）灭菌枪头、eppendorf管.
2、制备凝胶
1）安装玻璃板、板条,并将玻璃板固定在电泳槽中,以5%琼脂封底.
2）配制10%的分离胶（20ml）：依次将8ml蒸馏水,6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液,5ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液,0.2ml 10% SDS溶液,0.2ml 10%过硫酸铵,0.008mlTEMED混合,立即灌胶.
3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶,直至剩余的板宽比梳子长度多1cm.小心在胶上覆盖一薄层正丁醇.
4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中,配制5%的积层胶（8ml）：依次混合5.5ml蒸馏水,1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液,1.0ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液,0.08ml 10% SDS溶液,0.08ml 10%过硫酸铵,0.008TEMED.TEMED应在灌胶前才加入.
5）分离胶聚合完全后,倒去正丁醇,用蒸馏水冲洗胶面数次,用滤纸吸干胶面上的残余水.
6）灌注积层胶,立即插入干净的梳子,避免产生气泡.
7）积层胶聚合完全后,小心拔出梳子,用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次,以除去未聚合的丙烯酰胺.
8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液.
3、样品的制备
在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液,使蛋白的终浓度为3-4mg/ml,混合液在沸水浴中加热3分钟,冷却后即可上样.
4、上样
用微量进样器上样,每加入一种样品,应在下槽中洗涤加样器数次,最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液.
5、电泳
装好冷凝水系统,打开电源,初始电压为100-120V,当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后,将电压提高到200-220V,继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处.
6、后处理
1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板,用镊子小心撬开玻璃板,除去积层胶部分,将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定,直至染料由蓝绿色变为黄色.
2）染色：除去固定液,加入染色液（用量同上）,室温染色8小时或60℃染色2小时.
3）脱色：回收染色液,将凝胶浸泡于脱色液中,直至背景脱至无色,其间更换脱色液3-4次.
四、结果
绘制蛋白图谱,并对其进行必要说明.
五、注意事项
N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质,可经皮肤直接吸收,使用时应避免其直接接触皮肤,必要时应戴手套.但其凝固后就变成无毒物质.