如何能够在双元载体里面插入目的片段RT
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/09/02 01:09:30
如何能够在双元载体里面插入目的片段RT
如何能够在双元载体里面插入目的片段
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如何能够在双元载体里面插入目的片段RT
1、用Sal I和BamH I双酶切得到目的片段,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,这样目的片段的2端都是平末端.
2、用BamH I单酶切载体,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使载体的2端也成平末端.
3、将补齐后的目的片段连入补齐后的载体片段(目的片段无论是正向插入还是反向插入,BamH I酶切位点都没有了).然后采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点(目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行);此外,载体上应该没有该酶切位点.然后用所选择的酶切位点的相应内切酶和Sal I酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的(正向插入,暂且命名为质粒1).
4、用Sal I单酶切质粒1,再用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使质粒1的2端也成平末端.
5、将补齐后的目的片段连入补齐后的质粒1片段(目的片段无论是正向插入还是反向插入,Sal I酶切位点也都没有了).同样,采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点(目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行);此外,载体上应该没有该酶切位点(用上面所选的酶切位点应该就可以).然后用所选择的酶切位点的相应内切酶酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的反向插入就行了.