DNA粗提取实验步骤?

DNA粗提取实验步骤?
DNA粗提取实验步骤?

DNA粗提取实验步骤?
一 教学目的
1.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法.
2.观察提取出来的DNA物质.
二 教学建议
在本实验的教学中,教师应注意以下几点.
1.实验材料必须准备充足.本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得.每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液.宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡.如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂.
2.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器.鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少.因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失.
3.获取较纯净的DNA的关键步骤.
(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中.将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA.
(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h.
(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌.教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子.进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min.
三 参考资料
实验原理的补充介绍
1.DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来.为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法.蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂.同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA.但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起.
2.将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA.而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐.这时DNA在溶液中呈溶解状态.
3.DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离.这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物.再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了.如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA.
4.DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物.
5.DNA的沉淀和浓缩 除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩.最常用的方法是酒精沉淀法.就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中.如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分.浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用).
6.DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”).二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色).
鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关.
二苯胺试剂的配制
A液： 15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存.如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用.
B液： 乙醛的体积分数为0.2%的溶液.
配制： 将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用.
DNA粗提取与鉴定的另一种方法
1.材料用具
新鲜菜花(或蒜黄、菠菜).
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平.
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水.
2.方法步骤
(1)DNA的粗提取
①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h.
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎.
③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min .
④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中).在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液.
⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部).沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现.用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上.
(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀.
②鉴定 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝).用沸水浴(100 ℃)加热10 min .在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色).
研磨液的配制方法
Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品.
NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS：20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL.
若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解.如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用.
研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离.
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA.
物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA.
Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态.(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
鉴定DNA的其他方法 用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好.具体鉴定方法如下.
1.配制染色剂.用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液.
2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色.
3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处).

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