如何从植物细胞中制备大分子量的DNA
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/08/30 09:16:10
如何从植物细胞中制备大分子量的DNA
如何从植物细胞中制备大分子量的DNA
如何从植物细胞中制备大分子量的DNA
以玉米叶片的DNA提取为例
1 取3-5g新鲜的幼嫩的玉米叶片,或者取完材料后将其冻存于液氮中或保存在-70℃备用;
2将冷冻的叶片置于研钵中,加入少许石英砂,浇液氮研成细粉后,转入50 mL的离心管中,加入15ml 65ºC预热的2×CTAB抽提缓冲液,再加入150µlβ-巯基乙醇(终浓度为1%);
3 于65ºC温育1小时,中间间断的颠倒混匀几次,并开盖放几次气;
4 于冷水盆中冷却至室温后,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),快速上下颠倒混匀15分钟,然后于室温(>15℃)10000rpm离心10分钟.
5 取上清于新的干净的离心管中,加入0.8×体积异丙醇,混匀后于室温静置15分钟,用滴管将絮状沉淀挑出至一新的7.5ml的离心管中,加入76%的乙醇、乙酸钠洗涤片刻.
6 然后将溶液倒出,加入70%乙醇中洗沉淀2-3次.
7 将沉淀于37℃烘箱中凉干后溶于适量的(约2ml)TE中,加入含有去DNA酶的RNA酶(0.1%)于65℃进行消化30min左右,使其充分溶解,再放入37℃水域中消化1h.
8 加入0.5体积的酚进行抽提样品,即来回上下颠倒混匀15min左右,然后于微量离心机中10000rpm离心10min.
9 转移上清于另一新的7.5ml的离心管中,用TE补足原体积,在用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)进行抽提15min,然后在室温条件下于离心机中以10000rpm转离心10min,并再次转移上清于一新的离心管中.
10 向离心管中加入1/10体积的76%的乙醇、乙酸钠,再加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,于-20℃放置20分钟左右,然后用枪头将DNA挑出至新的1.5ml的离心管中.
11 向沉淀中加入70%的乙醇洗涤2―3次,并再次于烘箱中凉干,用300ulTE进行溶解DNA,于-20℃保存备用.