我自己用primer5.0和oligo6.0引物设计软件,设计了一对特异性引物老是有非特异性条带

我自己用primer5.0和oligo6.0引物设计软件,设计了一对特异性引物老是有非特异性条带 兼并引物设计都要注意些什么呢?用Primer5.0怎样设计兼并引物呢?简并引物设计都要注意些什么呢?用Primer5.0怎样设计兼并引物呢? PCR扩增基因设计引物时,用Primer5检测上游引物和下游引物的互补性,显示free energy= 1.50 Kcal/mol这样的引物可用吗? primer5.0引物设计所用序列为什么是mRNA?做qRT-PCR时设计引物是直接将NCBI的mRNA区域中CDS区序列拷贝到primer5.0里面,可是做qRT-PCR前不是有一步是将RNA逆转录成cDNA吗?那以mRNA设计引物不是反了吗?我 BLAST设计引物的问题?原来用Primer5.0设计引物,但是效果一直都不好,怀疑特异性不强,现在改用BLAST设计引物：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,但是在这一步,,我不知道如何选择参数,我是做 PCR引物设计原则,Primer5.0与DNAMAN哪个更全面? primer5怎么设计引物 ISSR-PCR引物的退火温度问题我做ISSR-PCR引物的退火温度能不能直接使用primer5.0这个软件计算得出的退火温度.理论上来说这是最佳的退火温度吗? 我第一次接触PCR,还请大家多多指教在设计引物时使用Primer Premier 5设计时显示的Tm值两条分别是64.8℃,64.6℃用Oligo6时显示出三种方法计算的温度,其中nearest neighbor法 upper 76℃ lower72.1℃%GC法 upper PCR时引物的概念包括加进去的酶切位点和保护碱基嘛?算进引物的长度吗?一块分析嘛?我设计的下游引物只有15个碱基,但primer5上的长度18个,如果我删去三个就不配对了（只是下游引物）,影响 已知引物序列,如何知道目的基因的长度我现在知道我的上下游引物序列,但是不确定目的基因的大小,有什么方法可以知道?我对primer5不是很了解,大体看了一下,没有发现用已知引物序列查询目 已知基因SCN2B,怎样用primer5设计引物,并添加酶切位点（Xho I-CCTCGAGG需标出）,写出引物序列和条件? 请教:PCR中,怎样检测自己设计引物的特异性请教达人,怎样用primer5检测自己设计的引物与模板（一个含有目的基因的载体）间的特异性?请详细点,非常感谢! 引物怎样设计才能包含所有的目的序列用primer5设计引物,总是剩下了一段序列,怎样才能把剩下的扩进来呢? 求oligo7或oligo6引物设计软件,破解版的, oligo6 中 oligonucleotide stability 与internal stability 含义的区别 我自己用英语翻译和它的主格 我不在乎别人的眼光,我只做自己喜欢和自己认为是正确的事 用英语怎么说