如何确保pcr产物以正确的方向克隆到表达载体中 (未翻译方向)
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/09/01 07:25:06
如何确保pcr产物以正确的方向克隆到表达载体中 (未翻译方向)
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如何确保pcr产物以正确的方向克隆到表达载体中 (未翻译方向)
完全确保的话,第一,做酶切的两个酶要不一样;二你在做完酶切后,用磷酸化酶处理下,纯化后再连接(这一不会降低连接效率,但会确保质粒不自连.按正确方向克隆
设计PCR引物时在上下游引物5'端加上不一样的酶切,PCR后通过双酶切将PCR产物克隆到表达载体上。
酶切后PCR产物只能顺着一个方向连接,粘性末端互补的才会连到一起…
连接前:两端的酶切位点的选择,可以锁定于载体中你需要的那一段;
连接后检测:连接上之后,可以摇菌提质粒,根据你插入的那段序列前后的其他酶切位点,选择一对或几对酶,然后电泳检测,如果插入的方向不一样,切割下的片段的长度是不一样的...
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连接前:两端的酶切位点的选择,可以锁定于载体中你需要的那一段;
连接后检测:连接上之后,可以摇菌提质粒,根据你插入的那段序列前后的其他酶切位点,选择一对或几对酶,然后电泳检测,如果插入的方向不一样,切割下的片段的长度是不一样的
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转基因为什么不能直接用PCR产物连接在表达载体上?我在做小麦转基因到拟南芥中,今天在想为什么不能把目标基因PCR后直接表达载体构建,而要用克隆载体后再构建表达载体?
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